Metodat molekulare biologjike kërkimore dhe përdorimi i tyre

Molekulare biologjike metodat e hulumtimit të luajnë një rol të rëndësishëm në mjekësinë moderne, shkencës mjeko-ligjor, dhe biologjisë. Në sajë të përparimeve në studim e ADN dhe RNA, personi është i aftë për të shqyrtuar gjenomin e organizmit përcaktuar agjent shkaktar, për njohjen e acidit nukleik të dëshiruar në një përzierje të acideve, etj

metodat molekulare-biologjike. Çfarë është ajo?

Kthehu në 70-80s e shkencëtarëve ishte i pari për të deshifroj gjenomit njerëzor. Kjo ngjarje i dha një shtysë për zhvillimin e inxhinierisë gjenetike dhe biologjisë molekulare. Studimi i vetive të ADN-së dhe ARN ka do të thotë se tani është e mundur që të përdorin këto acide nukleike me qëllim të diagnostikimit të sëmundjes, gjen studimit.

Përgatitja e ADN dhe RNA

Molekulare biologjike metodat diagnostike të kërkojë fillimin e materialit: shpesh kjo acidi nukleik. Ka disa mënyra për të zgjedhur këto substanca nga qelizat e organizmave të gjallë. Secili ka avantazhet dhe disavantazhet e veta, dhe kjo duhet të merret parasysh kur zgjedh një metodë e izoluar acidet nukleike në formë të pastër.

1. Përgatitja e ADN-së sipas Marmur. Metoda përbëhet në trajtimin perzierje substancash alkool, precipiton rezultuar e ADN-së e pastër. Dobësitë e kësaj metode është përdorimi i substancave korrozive, fenol dhe kloroform.

2. Izolimi i ADN-së të zgjerimit. Substanca kryesore që është përdorur këtu - është guanidine thiocyanate (GuSCN). Ajo promovon depozitimin e acidi dezoksiribonukleik mbi substrate të specializuara, nga të cilat mund të mblidhen më pas me anë të një tampon të veçantë. Megjithatë GuSCN - është një frenues i TCP, dhe madje edhe një pjesë e vogël e që merr depozituar në ADN mund të ndikojnë në rrjedhën e reaksionit zinxhir polimerazës, e cila është e rëndësishme kur punojnë me acideve nukleike.

3. Reshjet e papastërtive. Metoda ndryshon nga ato të mëparshme në se molekulat vetë nuk janë depozituar acid dehoksiribonukleinovoy dhe papastërtitë. Për ta bërë këtë, përdorni Këmbyesit jon. Disavantazhi është se jo të gjitha substancat mund të vendosen.

4. shqyrtimit Mass. Kjo metodë përdoret në rastet kur ju nuk keni nevojë që të kenë informacion të saktë në lidhje me strukturën e ADN-së, dhe nevojën për të marrë disa statistika. Shkaku është se struktura acid nukleik që mund të jetë dëmtuar kur trajtimin detergjentë, veçanërisht alkalies.

Klasifikimi i metodave hulumtuese

Të gjitha metodat molekulare-biologjike e hulumtimit janë të ndarë në tri grupe të mëdha:

1. amplifikimit (duke përdorur një shumicë të enzimave). Kjo përfshin PCR - reaksion zinxhir polimerazës, i cili luan një rol të rëndësishëm në shumë nga metodat diagnostike.

2. Neamplifikatsionnye. Ky grup i metodave është e lidhur direkt me punë i përzierjeve të acidit nukleik. Shembuj janë 3 lloje shlyen, në hibridizimi situ, etj

3. Metoda në bazë të njohjes së sinjal nga molekulës prove, i cili lidhet me një ADN-së ose ARN sonda veçantë. Shembull - Sistemi hibridizimi Hybride zgjidhje Capture System (HC2).

Enzimat që mund të përdoret në metodat molekulare kërkimore biologjike

Shumë teknika molekulare diagnostike përfshijnë përdorimin e gamë të gjerë të enzimeve. Më poshtë janë përdorur më shpesh:

1. kufizim enzimë - "prerë" molekulë ADN-në pjesët e nevojshme.

2. polymerase DNA - përmbledh një molekulë të dyfishtë-bllokuara acid dezoksiribonukleik.

3. transkriptazes reverse (transkriptases se kundert) - e përdorur për sintetizimin e ADN nga një shabllon ARN.

4. ligase DNA - është përgjegjëse për formimin e lidhjeve fosforodiesterike midis nukleotide.

5. exonuclease - heq nukleotide nga fundi pjesë të molekulës së acidit deoxyribonucleic.

PCR - metodë themelore e amplifikimin e ADN

reaksion zinxhir polimerazë (PCR) përdoret gjeresisht në biologjike moderne molekulare. Kjo metodë, në të cilën një molekulë e vetme ADN-së mund të merret një numër të madh të kopjeve (molekulë plotësuar).

Funksionet kryesore të PCR:

- diagnoza e sëmundjeve;

- klonimin e segmenteve të ADN-së, gjen.

Për të kryer reaksioni zinxhir polymerase kërkon elementet e mëposhtme: molekula fillestar DNA, një polimeraza termombjatës DNA (Taq ose Pfu), fosfatet deoxyribonucleotide (burimeve të bazave azotit), me abetaret (2 abetare 1 molekulë DNA) dhe vetë një sistem zbutës që mund të kryejë Të gjitha reagimet.

PCR përbëhet nga tre hapa: denaturation, pjekjen mbushësit dhe zgjatim.

1. denaturation. Në një temperaturë prej 94-95 gradë Celsius proshodit thyer bono hidrogjen mes dy zinxhirët e ADN-së, dhe si rezultat kemi dy molekula të vetme-bllokuara.

2. abetaret annealed. Në një temperaturë prej 50-60 gradë celsius ndodh abetaret pranimit në skajet e molekulave të vetme-bllokuara acidit nukleik sipas llojit të komplementaritetit.

3. Zgjatimi. Në një temperaturë prej 72 gradë është bijë sintetizuar bllokuar dyshe molekula e acidit dezoksiribonukleik.

sekuenca DNA

metodat molekulare kërkimore biologjike shpesh kërkojnë njohuri të sekuencës së nukleotideve në një molekulë të acidi dezoksiribonukleik. Për të përcaktuar kodin gjenetik sequenced. diagnostifikimi molekulare e së ardhmes do të bazohet në njohuritë e fituara në përcaktimin e sekuencës njeriut.

Llojet e mëposhtme të sekuenca:

• sekuenca nga MAXAM-Gilbert;
• Sanger sekuenca;
• pyrosequencing;
• nanoporovoe sekuenca.